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导读

，北京协和医院刘俊涛教授团队联合湖北省妇幼保健院陈欣林教授在国际著名期刊《Journal of Translational Medicine》上发表了题为《Clinical efficiency of simultaneous CNV-seq and whole-exome sequencing for testing fetal structural anomalies》[1]的文章。该研究证明，进行基因组拷贝数变异检测（CNV-seq）和全外显子组测序（WES）联合检测模式有助于胎儿超声结构性异常的快速诊断。陈欣林教授、蒋宇林教授及陈睿国博士为共同第一作者，程龙献教授、刘俊涛教授为并列通讯作者，贝瑞基因为该研究的共同完成单位。

研究背景

中国的出生缺陷发生率约为4%至6%。在对产前超声异常胎儿的诊断中，传统序贯检测模式一般为核型分析、CMA/ CNV-seq和外显子组测序（ES）顺序进行，然而这种模式一旦检测到致病性CNV后，一般不会再进行ES检测，这可能会导致其他遗传变异信息的遗漏，进而引起误诊或后续医疗服务不当。

本项研究旨在探索在大型中国人群队列中同步使用CNV-seq和全外显子测序进行胎儿结构性异常诊断的临床效能和获益。

研究方法

本研究自2018年6月至2020年10月，共计在湖北省招募1800名孕周超过11周且超声结构异常或颈项透明层（NT）增厚的单胎孕妇。最终，共计959个（男胎：557；女胎：402）家系符合入组条件并接受CNV-seq 和WES联合检测（详见图1）。

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图1：研究设计流程图。当前队列的排除基于样本质量、签署知情同意和提取的核酸质量，其中三例家系收样不全。

从家系样本中提取DNA，构建用于CNV-seq的PCR-free文库，在NextSeq CN500平台（贝瑞基因）上对样本进行文库测序；使用定制探针NanoWES（贝瑞基因）捕获初始基因组DNA，对文库进行制备和扩增，在NovaSeq 6000平台（Illumina）上进行双端测序。

测序结果与GRCh38参考基因组比对，对CNV和SNV/InDel进行注释，并根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南对致病性进行评级。仅报告致病性或可能致病的CNV和SNV/InDel。

研究结果

1、CNV-seq和WES联合检测模式有助于胎儿异常的诊断，提高诊断率

本次研究中，共227名胎儿报告为存在致病性或可能致病性CNV（n=109）和SNV/InDel（n=128)，总诊断率为23.67%。在这227名胎儿中，10名为双重诊断，CNV和致病性SNV/InDel（表2）。其中7例为CNV-seq和Trio WES联合检测模式发现的双诊断病例（数据未发表），占全部诊断结果的3.1%。若按核型分析-CMA-ES序贯的检测策略进行可能会误诊或失去基因信息。

在另外217名单一诊断的胎儿中，191名为新发变异（84.14%），包括99名CNV和92名SNV/InDel，10名胎儿存在X连锁母系遗传变异。

经超声成像检查显示832名胎儿存在单项异常，其中186名（22.36%）最终诊断为CNV或SNV/InDel（表1）。在这832名胎儿中，诊断率范围为9.30%至41.49%，不同类别间存在差异。有127名胎儿存在多系统异常，其中41名（32.28%）经诊断存在遗传变异，多系统异常的诊断率显著高于单系统异常（32.28%%，P=0.0183）。

2、CNV和变异诊断结果说明

在这109名诊断为CNV的胎儿中，30名（27.5%）诊断为微缺失和微重复综合征（MMS），另外79名（72.5%）存在的CNV经推测可能调节编码区。

报告的128个致病性SNV/InDel，其中75个是错义变异、19个是截断变异、14个根据计算机预测是操纵剪接区且影响pre-mRNA剪接的内含子变异或同义变异；另有导致其他后果的20个变异。

不同类别的诊断率分布情况各异。外显子级CNV在NT增厚的胎儿中诊出最多（5.00%），其他CNV（非外显子级）在多系统异常中的诊断率最高（19.69%）；诊断出SNV/InDel的综合征胎儿在NT增厚的胎儿中比例最高（10.00%）；单基因疾病胎儿占比最高的是骨骼方面缺陷的胎儿（23.40%），而只有5.32%的骨骼缺陷胎儿被诊断为综合征。

表1: 本研究队列中根据胎儿解剖系统统计的诊断分布

3、44种CNV和变异被多次诊出

本研究队列中， 涉及143名胎儿（14.91%）的44种CNV和SNV/InDel被多次诊出，最常见的是22缺失（13名胎儿，1.36%），其次是FGFR3变异（1.25%），具体频率如图2。

图2：当前总队列的胎儿中，CNVs和变异基因的诊断数量。对CNV和SNV/InDel双重诊断的胎儿进行多次计数。（DEL 缺失；DUP 重复）

CNV和SNV/InDel（双重诊断）的10名胎儿中，3名为先天性心脏病、3名为骨骼异常，2名为胎儿积水、1名面部异常以及1名胃肠道及腹壁异常。本研究中的胎儿C0290，经超声扫描检查显示全身皮肤水肿，并伴有腹水和胸腔积液。16中的致病性CNV（33.98kb缺失）造成了TSC2和PKD1基因的改变。据报告，NIPBL基因上的致病性SNV与胎儿一般性水肿有关，这是一项额外的预后信息。对于在不同解剖系统有一般症状的胎儿，双重诊断将充分证明胎儿的遗传致病性。

5、在所有综合征型胎儿中，最常见的5种综合征是DiGeorge综合征（14名）、Noonan综合征（10名）、Kabuki综合征（6名）、CHARGE综合征（4名）和Apert综合征（3名，见图3）。

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图3：在本研究队列中，5个诊断率最高的综合征的表型发生率分布。具有一种以上表型的胎儿统计多次。

6、表型不一致胎儿的诊断率显著低于表型一致的胎儿

本研究对800名胎儿的表型进行了比较。共计684名胎儿宫内和宫外表型（图4）表现一致。此外，116名超声结果显示异常的胎儿产后表型正常（图4）。在684名具有一致表型的胎儿中，172名（25.1%）诊断为遗传变异。在表型不一致的胎儿中，仅17名诊断为遗传变异，显著低于表型一致的胎儿（P=0.0130；图4）。

图4：诊断比例与产前超声成像结果和经尸检或产后检查确认的表型间的一致性有关。共计684名胎儿的宫内和宫外表型一致，其中，116名产前超声检查结果异常的胎儿产后表型正常。159名胎儿的宫外表型不详。

讨论

1、同步进行CNV-seq和WES检测胎儿异常可降低DNA起始量并缩短报告周期（TAT）

传统CMA的平均起始DNA在50ng-100ng之间。此外，普通外显子组测序的起始DNA也在50ng-100ng之间。本研究通过优化实验路径，用于同步进行CNV-seq和WES分析的样本在60ng-90ng，这对DNA起始量的要求显著下降。因此，对于孕早期胎儿或在仪器设备受限的地方医院接受检查的胎儿而言，本研究中的基因检测更为方便。

按序贯进行核型分析、微阵列和WES检测，各步骤的平均TAT分别为14天、14天和14-21天。在确认核型正常后，序贯式微阵列和WES检测，28-36天。然而，在本研究中，在对数据进行整合和平行分析后，整个路径的TAT能够限制在10-14天，这为产前阶段孕妇提供了一个更适用的策略。

2、对先天性缺陷遗传携带者的筛查不可忽视

在本研究队列中，在31名胎儿中发现了3个遗传性CNV和30个遗传性SNV/InDel，涉及43对证实为携带者的父母（12个双亲遗传，19个母系或父系遗传，2.24%）。此外有4例家系涉及在第一次妊娠终止后第二名胎儿出现复发情况。在这4名胎儿中，综合分析表明有1名为母系遗传模式，而其他3名为非正常结果，推断由胚系嵌合造成。这49对父母中43对确认为携带者，6对为疑似携带者，占研究队列的2.6%。

结论

通过此次研究数据可见，CNV-seq+WES联合检测有助于超声异常胎儿的诊断，在阐明具有复合原因的胎儿产前超声结构异常中具有至关重要的作用，减少起始DNA样本量。此外，多系统异常的诊断率显著高于单系统异常（32.28% VS 22.36%，P= 0.0183）。

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宫内和宫外表型一致的胎儿诊断率（172/684）显著高于表型不一致的胎儿（17/116，P=0.0130）。，在进行产前义。

参考文献

[1] Xinlin Chen, Yulin Jiang,Ruiguo Chen, Qingwei Qi,Xiujuan Zhang, Sheng Zhao,Chaoshi Liu,Weiyun Wang,Yuezhen Li,Guoqiang Sun, Jieping Song,Hui Huang,Chen Cheng, Jianguang Zhang,Longxian Cheng,Juntao Liu. Clinical efficiency of simultaneous CNV-seq and whole-exome sequencing for testing fetal structural anomalies. J Transl Med. 2022 Jan 3;20(1):10.doi:10.1186/s12967-021-03202-9

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